Việc đã mang lại cho ông tiếng tăm đó chính là việc phát triển kỹ thuật nhuộm màu vi khuẩn, làm cho chúng có thể nhìn thấy được dưới kính hiển vi. Sự bắt màu khác nhau của vi khuẩn đóng một vai trò hết sức quan trọng tỏng việc phân loại vi khuẩn sau này. Gram là một người khiêm tốn, và trong công bố đầu tiên của mình, ông nhận xét, "Tôi công bố phương pháp này, mặc dù tôi biết rằng nó còn nhiều khiếm khuyết và chưa hoàn hảo, nhưng hy vọng rằng dưới bàn tay của các nhà khoa học khác, nó sẽ thực sự hữu dụng." Phương pháp nhuộm Gram được tiến hành bằng cách sử dụng hai loại thuốc nhuộm cơ bản lầm lượt là tím tinh thể và thuốc nhộm safranin. Vi khuẩn sẽ bị nhuộm thành màu tím, lúc đó chúng được gọi là Gram dương, trong khi đó, một số vi khuẩn khác chuyển sang màu đỏ hồng, lúc đó chúng được gọi là Gram âm.